質(zhì)粒DNA分離和純化

質(zhì)粒DNA分離和純化：
純化要求
質(zhì)粒DNA中不應存在對后續(xù)實驗中的酶活性有抑制作用的有機溶
劑分子或過高濃度的金屬離子。避免其它生物大分子如蛋白質(zhì)、多
糖、脂類、基因組和RNA的污染。不同的后續(xù)實驗對于質(zhì)粒純度的
要求不同，常規(guī)的分子生物學實驗（如酶切、測序等）普通純度的質(zhì)粒
即可滿足實驗，而對于轉(zhuǎn)染實驗，要求質(zhì)粒的純度較高（如高純度或無
內(nèi)毒素）?？梢赃x擇不同的質(zhì)粒提取試劑盒以滿足不同的實驗要求。
純化方法
用硅基質(zhì)材料吸附質(zhì)粒DNA來代替乙醇沉淀的純化方式，提取的質(zhì)
粒純度高、操作方便快捷，可選擇的試劑盒有兩種類型，即普通質(zhì)
粒提取試劑盒和無內(nèi)毒素質(zhì)粒提取試劑盒。
質(zhì)粒DNA的洗脫和收集
參見基因組DNA提取
質(zhì)粒的保存
溶解在洗脫液TE中的質(zhì)粒DNA，也可以貯存在TE緩沖液中（用水溶
解的質(zhì)粒只能短期保存，因為實驗室用的純水呈弱酸性，質(zhì)粒在
酸性環(huán)境下會發(fā)生磷酸解），4℃短期保存或-20℃和-70℃長期保
存，也可在含有質(zhì)粒的細菌培養(yǎng)物中，加等體積甘油，于-70℃保
存 。
質(zhì)粒鑒定與評價：
瓊脂糖電泳檢測
堿裂解法提取的質(zhì)粒經(jīng)瓊脂糖電泳進行鑒定時，理想狀況是只出現(xiàn)
超螺旋—條帶，但在質(zhì)粒提取過程中，由于機械力、酸堿度、試劑
等原因，使質(zhì)粒DNA鏈發(fā)生斷裂，可能出現(xiàn)兩條帶或者出現(xiàn)三條
帶，這三條帶電泳遷移率從快到慢，分別是超螺旋、開環(huán)和復制中
間體（即沒有復制*的兩個質(zhì)粒粘連在—起）。如果加溶液Ⅱ后過
度振蕩，會在遠離這三條帶的位置出現(xiàn)條帶，這條帶泳動得較慢，
是大腸桿菌基因組DNA的片斷。非常偶然的是，有時候提取的質(zhì)粒
會出現(xiàn)4個以上的條帶，這是由于特殊的DNA序列導致了不同程度
的超螺旋（超螺旋的圈數(shù)不同）所致。但是，只要質(zhì)粒經(jīng)單酶切鑒定
后，只有單一條帶，就證明沒有基因組的污染。
酶切檢測
質(zhì)粒提取后，為了進—步鑒定質(zhì)粒的正確與否，就要進行酶切鑒
定，通過與Marker對比，確定質(zhì)粒的分子量大小。
用紫外線分光光度計檢測
濃度測定標準為：OD260值為1相當于大約50ug/ml雙鏈DNA。OD260/
OD280比值在1.7-1.9之間說明所得DNA純度較好。OD260/OD280比值
若低于1.7說明可能有蛋白污染。OD260/OD280比值若高于2.0則說明
DNA有可能已降解。如果洗脫時不使用洗脫緩沖液，而使用去離子
水，比值會偏低，因為pH值和離子濃度會影響光吸收值，但并不表
示純度低。